Projekt „Untargeted Profiling of Protein Pharmaceuticals“ erfolgreich abgeschlossen
Wir gratulieren Frau Yipei Yang zur erfolgreichen Bearbeitung des Projekts „Untargeted Profiling of Protein Pharmaceuticals: Simultaneous Determination of Identity, Protein Damage, as well as unknown By-products and Adulterations“, das von der Frankfurt Foundation Quality of Medicines gefördert wurde. Die Arbeit hat sie im Rahmen ihrer Master- und anschließender Promotionsarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Monika Pischetsrieder, Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
Proteinarzneistoffe müssen einer strengen Qualitätskontrolle unterzogen werden, die die Überprüfung der Identität beinhaltet, sowie von Proteinverunreinigungen, unerlaubten Zumischungen und Proteinschäden, die während der Herstellung und Lagerung auftreten. Ungerichtete Proteinprofilanalysen mittels LC-MS/MS haben das Potential, die Identität der Arzneistoffe, sowie Proteinschäden, Verunreinigung und Verfälschungen simultan zu bestimmen. Dabei sollten auch minimale strukturelle Veränderungen nachweisbar sein.
Im Rahmen ihres Masterprojekt hat Frau Yipei Yang deshalb die ungerichtete Proteinprofilanalyse eingesetzt um zu untersuchen, in wieweit damit die Qualität von kommerziellen Filgrastim Präparaten charakterisiert werden kann. Filgrastim wird zur Behandlung von Patienten eingesetzt, die durch Chemotherapie oder Immunsupression eine Immundefizienz aufweisen und wird dafür in E.coli rekombinant hergestellt.
Im ersten Teil optimierte Frau Yang eine LC-MS/MS Methode zur ungerichteten Proteinprofilaalyse und die anschließende bioinformatische Datenanalyse, wodurch eine komplette Sequenzabdeckung von Filgrastim erreicht wurde. Damit können auch schwer nachweisbare Mikroheterogenitäten im Protein erfasst werden. Die vollständige Identität der untersuchten Filgrastimlösung gemäß der Referenzwerte des Europäischen Arzneibuchs konnte bestätigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit erweiterte Frau Yang ihre Methode, um auch Proteinmodifikationen (PTM), die an Aminosäureseitenketten durch chemische Reaktionen während der Produktion und Lagerung auftreten können, mitzuerfassen. Durch die Verwendung einer maßgeschneiderte PTM Datenbank und der Anwendung eines neu entwickelten manuellen Filterworkflows konnte das Auftreten von falsch positiven Befunden minimiert werden. Mit dieser Methode sind 53 prozess-induzierbare PTMs erfassbar, die an 15 verschiedenen sensitiven Aminosäureseitenketten auftreten können. Um die Methode weiter zu validieren und die Bedeutung der nachgewiesenen Proteinschädigungen einordnen zu können, führte Frau Yang weiterhin Stresstests durch. Unter oxidativen Stressbedingungen wurden Oxidationen von Methionin-, Tryptophan-, und Cysteinresten des Filgrastim nachgewiesen. Glykierungsstress betraf selektiv einzelne Lysinreste und alkalischer Stress führte zur Deamindierung von Glutaminresten.
Damit konnte in der Studie eine ungerichtete LC-MS/MS Methode zur Proteinprofilanalyse entwickelt werden, mit der simultan die Identität und Proteinqualität eines Proteinarzneistoffs überprüft werden kann. Die Methode wurde für den Wirkstoff Filgrastim entwickelt, kann aber nun einfach auf andere Proteinwirkstoffe übertragen werden. In aktuellen Studien wird die Methode aktuell weiterentwickelt um Fremdproteine sowie Rückstände des Wirtsorganismus E.colinachzuweisen. Damit werden durch die ungerichtete Proteinprofilanalyse vier wichtige Qualitätsparameter (Identität, Proteinschädigungen, Verfälschungen und Verunreinigungen) von Proteinarzneistoffen simultan bestimmt werden können.
Die Studie wurde am Lehrstuhl für Lebensmittelchemie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg und am Gerätezentrum Massenspektrmetrie@FAU NeW unter Leitung von Prof. Dr. Monika Pischetsrieder von Frau Yang mit Unterstützung durch Lena Riedinger und Dr. Sabrina Gensberger-Reigl in Kooperation mit dem stellvertretenden Leiter, Dr. Tobias Borst der Apotheke des Uni-Klinikums Erlangen durchgeführt.
